微生物菌種凍干工藝流程

微生物的保存方法很多，根據(jù)不同的微生物菌（毒）株或不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選用不同的保存方法，其中常見的有斜面保存法，穿刺保存法、液體石蠟保藏法、沙土管保存法、冷凍保存法、真空冷凍干燥保存法。其中真空冷凍干燥保存法方便復(fù)活、保存期長(zhǎng)，運(yùn)輸和保存方便，活菌率高。

冷凍干燥是將菌體懸浮液冷凍到冰點(diǎn)以下，從而轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w結(jié)晶態(tài)，然后在低溫低壓(真空)下使固體升華而脫水的干燥方法。一般干燥處理過程會(huì)破壞微生物的細(xì)胞膜，引起細(xì)胞的大量死亡，因此需要添加保護(hù)劑，能夠使菌液密度均一，減少活菌在凍干過程中的機(jī)械效應(yīng)和溶質(zhì)效應(yīng)帶來的死亡。因此，在凍干前加入的保護(hù)劑配方就成為了至關(guān)重要的決定性因素，它既會(huì)影響到儲(chǔ)存期細(xì)胞的活性以及穩(wěn)定性，也會(huì)影響到復(fù)水時(shí)細(xì)胞存活率。

     凍干法是長(zhǎng)期保存細(xì)菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏體的標(biāo)準(zhǔn)方法（在凍干前一般要加冷凍保護(hù)劑，這樣可使細(xì)胞免除在冷凍初期因形成冰晶而造成的損害。ATCC 常規(guī)用10％脫脂奶或12％蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，而美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）的農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)人員用牛或馬血清作為微生物的冷凍保護(hù)劑（。在菌液中加入甘油和二甲亞砜（DMSO）也可防止冷凍中微生物的死亡，但實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)不同微生物決定應(yīng)用或不用保護(hù)劑。
    真空冷凍干燥法保存菌種的步驟主要包括：

1、微生物培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得健壯的菌種擴(kuò)培液體。培養(yǎng)時(shí)根據(jù)菌種選擇不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期獲得大量健壯的菌種，保證菌體濃度，一般達(dá)到10⁹的濃度.

2、離心收集菌體。通過離心法從液體培養(yǎng)基中獲得菌體。如果是固體培養(yǎng)基可以直接收集菌落，用保護(hù)劑溶解混勻。

3、將菌體、脫脂奶粉、海藻糖、蔗糖等保護(hù)劑在無菌水中混勻得到含有保護(hù)劑的菌體混懸液。

4、分裝。將菌體混懸液在無菌環(huán)境中分裝到無菌容器中，可以是安瓿瓶、西林瓶、EP、培養(yǎng)皿等。

5、預(yù)凍，預(yù)凍是非常關(guān)鍵的。預(yù)凍不好，菌體會(huì)死亡。要快速預(yù)凍，防止產(chǎn)生大冰晶造成細(xì)胞死亡。預(yù)凍要凍結(jié)實(shí)，保證預(yù)凍充分。

6、將預(yù)凍好的菌體，放入真空冷凍干燥設(shè)備中進(jìn)行凍干。如果是設(shè)備帶預(yù)凍功能，也可以直接在凍干機(jī)上進(jìn)行預(yù)凍。真空冷凍干燥時(shí)間和凍干曲線的 設(shè)計(jì)要根據(jù)菌種的不同和菌體混懸液的濃度等進(jìn)行設(shè)計(jì)。凍干好后真空密封保存。

   微生物凍干法采用的凍干設(shè)備可以有多種選擇，從實(shí)驗(yàn)室凍干機(jī)到研發(fā)型凍干機(jī)都可以適用。如以下系列凍干機(jī)都可以用來凍干保存微生物。